Полимеразная цепная реакция

На эту статью установлено перенаправление со страницы «ПЦР», см. также другие значения этого термина.


Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Содержание

Принципиальная схема ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Проведение ПЦР

С помощью ПЦР амплифицируются короткие (до 10 kb[1]) участки ДНК с известными концами.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ПЦР проводят в термоциклёре — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно, с точностью не менее 0,1°С.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 букв. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг [2]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина сайтов связывания праймера занята. Tm можно приблизительно определить по формуле T_m = 2\cdot(n_A+n_T)+4\cdot(n_G+n_C), где nX — количество нуклеотидов Х в праймере. Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Сверху температура плавления ограничена оптимумом действия полимеразы, активность которой падает при температуре выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

  • GC-состав ~ 40—60 %;
  • близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
  • отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[3] и димеров[4];
  • желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 2).

  1. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.
  2. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин.
  3. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10—15 мин.

Разновидности ПЦР

  • «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения доли побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
  • «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить фланкирующие последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим лигированием. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
  • ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — используется для амплификация, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят транскрипцию молекулы РНК с помощью обратной транскриптазы и получют кДНК. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
  • Ассиметричная ПЦР (англ. Assymetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
  • Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.
  • Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
  • Touchdown ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.
  • ПЦР на колониях (англ. Colony PCR) — бактериальные клоны проверяют на наличие продуктов лигирование. Колонии отбирают с чашки с агарозным гелем, добавляют праймеры и выдерживают при 95°С продолжительное время, чтобы разрушить клеточные стенки бактерий.
  • ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)
  • ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 kb и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
  • RAPD PCR (надо написать)

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые буквы. Например, последовательность праймера может быть таким: ...ATH..., где Н - А, Т или С.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминология

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточного совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint). Поскольку есть небольшая вероятность, что у двух человек отпечатки окажутся похожими, этот метод чаще используется для доказательства невиновности подозреваемого.

Установление отцовства

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключнием случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соотетствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы.

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов из одного организма и вставки их в другой. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужерожный ген в другой организм. В качестве векоторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или белка. Это называется экспрессией гена. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельком хозяйстве, медицине и др.

Мутагенез

Мутагенез — это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК. Мутагенез широко используют для изучения белков и улучшения их свойств (направленной эволюции(англ.)). ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез(англ.) с использованием пары праймеров, несущих мутацию, а также случайный мутагенез. В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся полимеразой в условиях, понижающих ее специфичность.

Ссылки

Литература

  1. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X

Сноски

  1. 1 kb (kilo base pair(англ.)) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК
  2. Отжиг (англ. annealing) — гибридизация фрагментов ДНК
  3. Шпилька — внутримолекулярная самокомплементарная структура
  4. Димер — межмолекулярные структуры, образумые праймерами друг с другом или сами с собой

 
Начальная страница  » 
А Б В Г Д Е Ж З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Ы Э Ю Я
A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Home